基因编辑技术及相关IVD产品简述

　　基因编辑技术通常是指利用基因编辑系统进行分子生物学操作的技术。本文所述基因编辑系统是一大类序列依赖的基因剪切酶的统称，使用最广泛的为CRISPR/Cas系统。其中CRISPR全称为Clustered Regularly Interspaced Short  Palindromic Repeats, 译为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”;Cas指的是CRISPR-associated, 译为“与CRISPR相关的(蛋白)”，可以理解为与CRISPR相关的具备某种或某些(剪切)酶活性的蛋白。由于这个系统包含CRISPR相关的剪切蛋白，因此实现了基因的剪切-拼接，达到“编辑”功能。因此，CRISPR也成为基因编辑技术的代名词。

　　□ 陈亭亭

　　CRISPR/Cas系统应用场景广泛

　　基因编辑现象最早发现于原核生物中，是细菌抵抗病毒的自适应免疫系统。简要来说，其原理是细菌首次被病毒入侵时，基因组序列整合了病毒的基因组而形成一段CRISPR。当再有外源性病毒(质粒或噬菌体)入侵时，该段CRISPR可以识别再次入侵的外源脱氧核糖核酸(DNA)，细菌利用自身的Cas相关蛋白切断外源的基因组变为线性，使病毒无法复制和表达，最终被降解。

　　基因编辑系统中的CRISPR/Cas系统具有识别序列并剪切的特性，使其成为基因编辑领域的良好工具。目前已发现并研究了多种CRISPR/Cas系统，包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a等。特别是近几年发现的Cas12a、Cas13a等，不仅具有识别并剪切目标基因的特性，还能无差别剪切DNA/RNA(核糖核酸)。根据此特性，研究人员将DNA/RNA设计成标有荧光报告基因和淬灭基因的报告基团。当用CRI SPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a识别、剪切目标基因时，能同时剪切下荧光报告基因，其释放的荧光数和靶基因数量一致，这样可以通过荧光检测设备检测的荧光数量来间接检测靶基因。该项检测在遵循实验室生物安全管理相关规定的前提下，应用场景广泛。

　　基因编辑IVD产品研究火热

　　目前，已有多种有关基因编辑体外诊断(IVD)产品应用研究的文章发表。根据这类文章，研究方法通常先从人体样本中提取目标核酸(如病毒的DNA或RNA)，Cas经过一段先导RNA(guide RNA,gRNA)的设计，引导其配对至目标核酸序列位置，再通过RPA(Recombinase Polymerase Amplification，重组酶聚合酶扩增)扩增放大其中目标基因的浓度，随后采用基因编辑技术进行剪切并释放荧光信号，进而对荧光信号进行检测。如采用CRISPR/ Cas12a识别单链DNA开发的检测人体样本中人乳头状瘤病毒HPV 16和HPV18的试剂，也叫DETECTR(DNA endonucleasetargeted CRISPR trans reporter)。张锋(美国麻省理工学院华人科学家)团队结合前期研究开发了SHERLOCK(specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking)方法。该方法基于Cas13a，采用RPA扩增技术和RNA引导Cas13a进行信号剪切。连接在RNA上的技术荧光信号，利用Cas13a附带的无差别剪切RNA功能，实现释放，但该团队认为开发产品的难点在于提取纯化Cas13a。再如其他团队采用另外一种更简便快速的样本处理方式HUDSON(heating unext racted diagnosticsamples to obliterate nucleases)来处理诸如咽拭子、唾液、尿液等样本，并结合SHERLOCK方法，可以很好地检出如寨卡病毒、登革病毒、黄病毒等RNA病毒。由于HUDSON仅通过加热免提取来处理临床唾液或尿液样本，抛开了繁复的核酸提取过程，今后有望应用于即时检验(POCT)的现场检测，或可供世界卫生组织采购用在实验条件有限的国家和地区。还有团队开发了用于人基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测方法等。

新冠病毒同属于RNA病毒。2020年5月，美国食品药品管理局(FDA)通过紧急使用授权(for Emergency Use Authorization only，EUA)，首次批准了张锋团队开发的基因编辑IVD产品——SHERLOCK方法学定性检测人体上呼吸道样本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因。从检索批准文件和产品说明书上看，该产品是一个仅限在实验室使用而非可以广泛使用的产品，需要采用Thermo公司的RNA提取试剂盒，严格遵循核酸提取纯化步骤来完成，并非如文献报道的那样采用加热免提取的方法来处理临床样本。在分析性能方面，该产品最低检出限N基因为1.35copies/ul VTM，ORF1ab基因为6.75copies/ul VTM，从提取至检测出结果的时间不超过2小时。

　　我国已有相关产品获批

　　国内目前已进入优先/应急审评的国产基因编辑方法学的新冠病毒检测产品中，已批准的产品有2个，处于沟通交流及资料完善中的产品有1个。从现有资料看，上述产品采用的是不同基因编辑系统。一种为国内厂商使用的CRISPR/Cas12a以及CRISPR/Cas13a系统，该系统与国际研究相符。Cas12或Cas13除了靶向剪切目标核酸序列外，还附带无差别剪切核酸信号的功能。国内厂商通过外购获得Cas12a和Cas13a两种剪切蛋白，尚未具有自行制备的能力。第二种为CRISPR/Cas12b剪切系统。该系统是我国自主研发并已申请国际、国内专利，目前产品已完成注册检验，处于沟通交流及资料完善阶段。目前，国产产品从批准和完成注册检验的情况看，可以满足新冠病毒国家参考品和临床使用的要求。

　　从发现到临床实践的应用探索，除了最初带给人类的惊喜外，研究人员逐渐认识到CRISPR/ Cas系统家族应用的优缺点，目前针对其缺点仍在不断进行改造并应用于不同领域。近年发现的Cas12及Cas13，相较早先的Cas9基因编辑系统具有更好的准确性，解决了脱靶效应的问题，同时其附带的无差别剪切功能契合了IVD中需要释放检测信号的需求。

　　准确、快速、简便、经济一直是IVD开发的目标，就目前来说，CRISPR应用到IVD是一个划时代的发现，其精准性、快速性逐渐得到科研人员认可。随着提取技术、等温扩增技术的应用以及更新更好的Cas蛋白的发现，CRISPR技术能否有专属应用场景还有待观察。

　　(作者单位：国家药监局医疗器械技术审评中心)