灵敏度提升33倍，高效血液HPV检测方法来了

影像学检查和肿瘤活组织检查是临床上肿瘤诊断和监测的主要手段，这些检查在治疗前的确非常有效，但是频繁和重复的影像学检查及活检用于术后监测是不切实际的。液体活检（Liquid biopsy）技术是指通过采集和检测人体体液样本实现肿瘤监测的一种技术，虽然尿液、粪便、脑脊液、唾液、腹水等体液都是肿瘤源性物质的潜在来源，但血液仍然是主要的液体活检样本。

相比于传统的肿瘤检测方法，液体活检技术具有取样方式灵活、无创便捷、可以反复多次取样、依从性高等特点，因此可能在肿瘤筛查、疗效检测、用药指导等方面发挥重要作用。

液体活检与HPV病毒

液体活检样本中存在多种携带肿瘤相关信息的物质，包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和RNA、肿瘤细胞释放的外泌体等等。其实正常人的血液中，也含有一些片段化的DNA，我们称之为cfDNA，科学家认为这些cfDNA是通过细胞凋亡或者坏死释放到血液中的，进入血液之后，cfDNA会被快速从血液中清除，半衰期不超过1小时，健康人血浆中的正常细胞的cfDNA含量是比较低的。

而ctDNA就是指从肿瘤细胞中释放出来的DNA，与正常的cfDNA在序列特征上有一些差别，因此，通过对血浆中ctDNA进行测序，就可以了解很多肿瘤的相关信息，

尤其是对于某些病毒感染引起的肿瘤，其cfDNA中往往含有很多病毒特异性的基因信息。

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种广泛感染人类的病毒，大多数HPV的感染对人体无害，在两年内可以被人体的免疫系统自行清除，但持续的高危型HPV感染可以导致多种癌症的发生，对全人类的健康造成严重威胁。

在美国，每年有1400万人感染HPV病毒，大多数人一生中至少会感染1次HPV病毒，每年与HPV相关疾病（疣、癌前病变、癌）相关的总医疗费用高达80亿美元。2009年，美国估计有34788例新发性与HPV相关癌症，包括宫颈癌、肛门癌、口咽癌和外阴癌等，其中最常见的口咽癌和宫颈癌，这些癌症中很大一部分由HPV16型和18型引起。

图1 HPV 16型病毒粒子结构

在HPV病毒引起的肿瘤中，通过病毒基因组可以区分ctDNA和正常细胞来源的cfDNA，因此，可以对患者血浆中cfDNA进行检测来了解患者的肿瘤负荷情况。

ctDNA可作为HPV引起肿瘤监测指标

一项研究探讨了HPV相关的ctDNA作为口腔鳞癌复发的指标可行性。HPV引起的口腔鳞癌治疗效果远远优于非HPV感染的口腔鳞癌，然而仍然有10%~25%的患者会在治疗后出现疾病复发。CtDNA水平的动态变化与肿瘤的转移或者患者的治疗反应相关。

有研究纳入了115例HPV相关的口腔鳞癌患者，所有患者均接受治疗性放化疗（CRT），患者接受3个月的治疗性放化疗后PET-CT，在之后的1~2年中，每2~4个月进行临床评估，在3~5年期间每6个月进行一次评估。每6~9个月收集一次患者血液样本，使用多重分析数字化PCR分析血浆中的HPV相关ctDNA，所有患者的中位随访时间为23个月。

图2 DOI：10.1200/JCO.19.02444

其中，15名患者出现疾病复发，87例患者在治疗后各个时间点均没有检测到HPV相关ctDNA阳性，这些患者也均未出现复发，28名患者在治疗后监测中出现ctDNA阳性，其中15人复发，而16名患者连续2次血液检测呈现阳性，复发的15名患者均在其中。HPV相关的ctDNA阳性与活检证实复发之间的平均时间为3.9个月。

这项研究证实，基于HPV相关的ctDNA检测用于HPV相关肿瘤复发的监测是可行的，其他一些类似的研究也验证了这一结论。

然而，当下的ctDNA检测多采用定量PCR（qPCR）和数字化PCR（dPCR），存在精度不够的问题，

当DNA的拷贝数小于1时，采用这些方法检测会有一些困难，如何提高检测的敏感性，是科学家一直关注的问题。

超高HPV ctDNA检测助力肿瘤液体活检

近日，来自加拿大多伦多的玛嘉烈公主癌症中心的研究人员在Clinical Cancer Research上发表了一篇题为HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA的文章，这项研究提供了一种超敏感的HPV特异性ctDNA的检测方法，HPV-seq大大提高了检测的敏感性，能够在dPCR阴性的治疗后样本中检测到低至0.03 拷贝/ml的ctDNA。

图3 DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-2384

图4 HPV-seq和双链杂交捕获原理

HPV-seq采用了一种双链杂交捕获的方式从序列文库中富集病毒DNA，能够定性和定量地提供HPV相关肿瘤患者ctDNA的信息，不仅具有超高的敏感性，而且能够提供ctDNA的片段长度和HPV基因型信息。每个全长的病毒基因组大约能够产生50种不同的cfDNA片段。

结果显示，HPV-seq 的结果和dPCR具有高度相关性，而且能够检测出dPCR不能检测到的ctDNA，治疗结束后检测到HPV ctDNA与较差的无病生存期相关，

其对疾病复发预测的敏感性为100%，特异性为67%。对HPV型别鉴定的准确率达到100%。

HPV ctDNA片段的大小始终短于非癌症来源的cfDNA片段，并且在HPV基因组中观察到固定的cfDNA片段组模式。

总之，本研究提出的HPV-seq确实是一种有效的ctDNA定量方法，优于传统的dPCR。

通过这种超高敏感性的检测方法，可以迅速发现患者是否有肿瘤复发的倾向，更早地采取行动，对于提高患者预后具有重要意义。同时，这项技术也可以用于其他由特定病原体引起的癌症的检测和治疗，造福更多肿瘤患者。

参考资料：

1、 Chera BS, Kumar S, Shen C, et al. Plasma Circulating Tumor HPV DNA for the Surveillance of Cancer Recurrence in HPV-Associated Oropharyngeal Cancer [published correction appears in J Clin Oncol. 2020 Oct 20;38(30):3579]. J Clin Oncol. 2020;38(10):1050-1058.

2、 Corcoran RB, Chabner BA. Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment. N Engl J Med. 2018 Nov 1;379(18):1754-1765.

3、 王传新.肿瘤液体活检[J/OL].山东大学学报(医学版):1-8[2021-09-30].

4、 Cheung TH, Yim SF, Yu MY, Worley MJ Jr, Fiascone SJ, Chiu RWK, Lo KWK, Siu NSS, Wong MCS, Yeung ACM, Wong RRY, Chen ZG, Elias KM, Chung TKH, Berkowitz RS, Wong YF, Chan PKS. Liquid biopsy of HPV DNA in cervical cancer. J Clin Virol. 2019 May;114:32-36.

5、 Eric Leung et al, HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA, Clinical Cancer Research (2021).