Neuron｜综述：从细胞分化层面解析神经母细胞瘤发生机制

撰文 | 梁颢严 责编 | 霍子荷

早在一个世纪以前，病理学家便发现了癌症与细胞分化停滞之间的联系，一般来说，低分化的肿瘤往往恶性程度更高。这在儿童肿瘤中也不例外，其中最具代表性的就是神经母细胞瘤。

作为儿童时期最常见的颅外实体肿瘤，神经母细胞瘤一直以来都是儿童癌症相关死亡的主要原因。既往的研究揭示神经嵴来源的交感肾上腺谱系细胞的分化停滞在神经母细胞瘤的发生中起到了重要的作用，也解释了该疾病的诸多生物学特征，包括细胞异质性、突变谱、自发性消退，以及对诱导肿瘤分化的药物的反应等。

2022年8月9日，来自约翰霍普金斯大学和 St. Jude 儿童研究医院的研究者们在Neuron发表了题为Neuroblastoma: When differentiation goes awry的综述文章，整理了神经母细胞瘤作为一种分化停滞疾病的分子、细胞、基因以及表观遗传证据，回顾了揭示神经嵴来源细胞发育异质性的单细胞转录谱，强调了细胞异质性和分化停滞在探索神经母细胞瘤生理和治疗方面的重要性。

要点总结

1）神经母细胞瘤起源于交感肾上腺谱系细胞的分化停滞，肿瘤细胞可大致分为神经元性细胞（ADR）、非神经元性细胞（MES，也可称为间充质细胞）

2）既往研究提示神经母细胞瘤的异质性与正常发育过程中的异质性有关，近年来的单细胞/单细胞核测序技术为探索肿瘤中细胞系之间的关系、细胞类型的相互转换提供了帮助

3）仔细、透彻地了解神经母细胞瘤中细胞之间的关系在临床实践中至关重要

4）尚需开发针对复发、高危患者以及肿瘤细胞中的间充质细胞的治疗方法

1. 起源：神经母细胞瘤起源于神经嵴来源细胞

19世纪中叶，神经母细胞瘤第一次作为儿童肿瘤被Dalton等人报道。20世纪初期，Wright等人发现神经母细胞瘤存在一些与交感神经元细胞相似的纤维，从而引发了这一疾病起源于神经系统的相关思考。后续半个世纪里由多个团队主导的一系列观察性研究，为神经母细胞瘤起源于发育中的交感肾上腺谱系细胞这一重要的思想奠定了基础。

随着分子生物学技术的迅速发展，研究者们对神经母细胞瘤起源的探索不断深入。研究发现，在胚胎早期发育时期，神经嵴细胞从胚胎背部的神经管向远端迁移，最终形成了交感肾上腺谱系细胞。这些神经嵴细胞是具有多能性的祖细胞，而最终分化成的细胞类型，则由其在胚胎中轴（rostro-caudal axis）上的具体位置决定。

神经嵴细胞分化成的细胞类型由其在胚胎中轴（rostro-caudal axis）上的具体位置决定

然而，某些细胞外部因素也会对神经嵴细胞的分化产生影响。例如当躯干部位的神经嵴细胞（在胚胎发育的过程中）迁移到头部时，同样会分化为头部神经嵴细胞来源的骨细胞、软骨细胞等间充质细胞（mesenchymal, MES）。

此外，神经嵴细胞具体分化为胆碱能细胞还是肾上腺能细胞（adrenergic, ADR），也会受到细胞内部因素的影响。这些发现共同说明了来源于神经嵴的成交感神经细胞不仅能分化成神经细胞，还具有分化成为间充质细胞的巨大生物学潜能。

成交感神经细胞分化为2种类型的神经母细胞瘤细胞的生物学潜能

自主神经系统由中枢神经系统起源的胆碱能节后神经细胞、神经嵴起源的肾上腺能细胞（adrenergic, ADR）或胆碱能节后神经细胞组成。

肾上腺髓质中的嗜铬细胞正是上述的神经嵴起源的肾上腺能细胞，它并不像其它的自主神经细胞一样生成树突或轴突，而是直接分泌神经递质（肾上腺素和去甲肾上腺素）。嗜铬细胞由紧急暴露于乙酰胆碱或长期暴露于由ADCYAP1基因编码的垂体腺苷酸环化酶激动多肽（pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide, PACAP）激动。虽然大部分神经母细胞瘤表达高水平的儿茶酚胺合成酶，有一部分表达的却是高水平的PACAP 神经肽以及乙酰胆碱合成酶。这一差异是否能反应神经母细胞瘤究竟是交感肾上腺谱系细胞起源，还是嗜铬细胞起源，是一个仍待解决的问题。

除了上述的自主神经细胞外，神经嵴起源的成交感细胞也可生成施旺细胞前体细胞（Schwann cell precursors, SCPs）。SCPs是一类多能祖细胞，可以分化成为施旺细胞、黑素细胞、间充质细胞等多种细胞。近期有研究提示SCPs可跨越间充质-神经细胞之间的发育界限，提示嗜铬细胞可有早期、晚期两种来源。

2 分子生物学特征

2.1 神经母细胞瘤中主要的2种细胞类型

神经母细胞瘤细胞异质性可反映交感肾上腺谱系细胞发育异质性，这一发现最早来源于对神经母细胞瘤细胞系的研究。在20世纪末期分子生物学技术有限的情况下，研究人员便发现了神经母细胞瘤中至少存在2种细胞类型，其中神经元型细胞（N-type）具有神经纤维结构、可分泌神经递质等特征，底物粘附性细胞（S-type）细胞则具有扁平、依附其他细胞而生等形态学特征。后续发现S-type细胞具有和神经嵴起源的非神经细胞（间充质细胞）类似的基因表达及蛋白分泌能力。

经过数十年的探索后，研究者们逐渐达成了以下共识——

1）神经母细胞瘤至少由两种细胞构成

2）具有神经特征的称为“神经元型细胞”，N-type，group I，ADR-type

3）不具有神经特征的称为“底物粘附性细胞”，S-type，group II，MES-type

4）体内外实验已证实两种细胞类型在特定培养条件中可互相转换，可能解释了嗜铬细胞的两种来源等复杂生物学现象

2.2 神经母细胞瘤vs.交感肾上腺组织发育

尽管先前研究发现神经母细胞瘤细胞可大致分为两种类型，但事实上，仍有部分细胞是难以通过基因表达标记将其进行分类的，它们中有的同时表达了两种细胞的基因，有的表达了两种细胞的杂合基因。同时，这些细胞究竟来源于发育中的正常转换，还是肿瘤组织的一部分，也难以通过单纯的细胞分类进行解答。

为了进一步探究这些问题，多个研究团队都对进行了神经母细胞瘤以及胚胎中正在发育的交感肾上腺谱系进行了单细胞测序。测序研究成果大致如下：

1）几乎所有患者的肿瘤组织中都存在肾上腺能细胞，肿瘤细胞具有神经细胞的分化特征

2）具有更多分化的ADR基因表达特征的患者，预后较好

3）通过拷贝数分析鉴别肿瘤细胞的方法不尽准确，但间充质细胞的存在可反映是否能应用拷贝数分析进行鉴别、数据质量、用于注释肿瘤细胞的计算方法的变异度

4）是否通过少量基因人工注释细胞集群、是否使用无偏倚方式辨别细胞类型，可从一定程度上反映细胞分类的准确性

5）在使用单细胞测序数据辨别细胞类型时，要考虑到交感肾上腺组织发育在人和小鼠中的异质性

然而，仍有很多问题等待未来的探索：

1）在神经管发育过程中，非细胞自身因素如何影响胚胎中轴（rostral-caudal axis）上间充质细胞的分化方向

2）与神经母细胞瘤中的细胞转换类型相关的发育过程中细胞类型转换机制解释

2.3 神经母细胞瘤的分子突变谱

1）PHOX2B

基因突变谱也为神经母细胞瘤来源于细胞分化阻滞提供了依据，其中PHOX2B就是最好的例子。交感肾上腺组织发育需要PHOX2B激活下游转录因子，从而发生下一步的细胞分化，家族性神经母细胞瘤中的PHOX2B低表达可导致细胞向恶性转换。

2）ALK

ALK基因是家族性神经母细胞瘤中最常见的提示倾向性的基因，也在散发病例中呈现体细胞突变，ALK基因突变可通过激活配体依赖激酶导致癌症发生。此外，ALK表达于发育中的神经嵴，ALK缺陷小鼠可表现出神经组织分化异常。

3）MYCN

肿瘤发生的通路与细胞生长发育的通路密切相关，因为增殖与分化在发育过程中需要紧密配合。例如MYCN基因过表达可阻滞分化、促进肿瘤发生。

4）ATRX

在发生了染色体重塑的个体中出现的复发性体细胞突变里，最常见的是ATRX，且与疾病高风险、诊断时年龄偏大、较差的预后有关。ATRX在神经系统发育中起到了重要作用，一旦发生胚系突变将导致发育缺陷以及神经细胞死亡。与PHOX2B不同的是，ATRX不会导致神经母细胞瘤易感性增加，提示了肿瘤发生过程还需要其他基因的参与。

研究发现，ATRX突变通过维持端粒可变增长（alternative lengthening of telomeres, ALT）、阻滞神经组织分化促进肿瘤生成。在肿瘤发生过程中，潜在致瘤基因与抑癌基因突变通常会协作，但在神经母细胞瘤中，潜在致瘤基因（例如MYCN）与抑癌基因（ATRX）却并不是互相合作的。

3 临床相关发现

3.1 神经母细胞瘤的自发消退现象

虽然总体预后不佳，神经母细胞瘤却是拥有最高的自发消退比例的肿瘤之一，大部分自发消退发生于确诊年龄小于18个月的患者。研究者们也对自发消退机制进行了相关探索，可能的机制包括：旁分泌信号的缺失，无法维持端粒，免疫排斥和交感神经分化过程的表观遗传学激活。比如NTRK的相关通路。具有NTRK1高表达的新生儿患者会在NGF存在时肿瘤会生长一段时间，但是随着NGF的降低，肿瘤会自发消退；相反，NTRK2介导的BDNF信号通路，则会出现在MYCN扩增且预后较差的患者身上。患者身上出现NTRK家族介导的发育通路异常，可能与诊断年龄不同的患者的疾病异质性有关。

由于某一些“患者”的肿瘤可能在诊断之前就发生了自发消退，研究者们认为自发消退的实际比例高于现有观测值。此外，自发消退还可能与施旺细胞前体细胞（Schwann cell precursors，SCPs）在不同时期的不同分化方向有关（参考上文“成交感神经细胞分化为2种类型的神经母细胞瘤细胞的生物学潜能”示意图）。

3.2 “诱导分化”的治疗效果

迄今为止，维甲酸（retino acid，RA，也称视黄酸）依旧是体内外实验中诱导神经母细胞瘤分化最有效的药物。13-反式维甲酸（维甲酸衍生物）则迅速进入了临床试验，并已成为了神经母细胞瘤的标准疗法之一。

另一个利用神经母细胞的分化特征进行治疗的策略是免疫疗法。针对神经母细胞瘤细胞表面的GD2受体的抗-GD2免疫治疗也已成为了高危神经母细胞瘤的标准疗法，研究者们也在持续进行着对减少副作用以及提高治疗效果的探索（更多抗-GD2免疫治疗相关研究进展可在公众号内搜索关键词“GD2”）。

由于神经母细胞瘤细胞具有摄取儿茶酚胺及其代谢物的特性，作为儿茶酚胺类似物的一种，间碘苯甲胍（MIBG）也已被应用于神经母细胞瘤的诊治：8天半衰期的131I-MIBG用于治疗，13小时半衰期的123I-MIBG用于诊断。目前，MIBG已用于治疗复发性神经母细胞瘤，用于高危患者的治疗正处于试验阶段。

然而，现有的治疗方式也仅能囊括部分神经母细胞瘤患儿，抗-GD2免疫治疗和MIBG仅针对于肾上腺能（ADR）表型的神经母细胞瘤，RA仅能用于诱导分化阻滞，间充质细胞（MES）等肿瘤部分尚缺特异性疗法。未来应聚焦于根据神经母细胞瘤的异质性开发不同疗法，并将交感肾上腺组织的分化、不同谱系细胞之间的关系用于临床实践当中。

4 未来待解决的问题

近年来较为深入的基因研究有助于厘清肿瘤组织在治疗前以及治疗后的具体细胞构成，但对于那些在治疗逃逸以及疾病复发中发挥了重要作用的细胞表型依旧知之甚少。单细胞测序/单个细胞核测序技术为这一领域的探索提供了新的希望，研究者们开始逐渐了解上述提到的这些细胞，并发现它们的行为可能与神经母细胞瘤中两种细胞类型之间的转换有关。

此外，新兴的研究技术以及研究方法也有助力于更加深入地了解神经母细胞瘤复发机制，以及能够预测肿瘤行为和（或）治疗反映的生物学指标。神经母细胞瘤复发的患者总体生存率目前仍低于10%，足以见得这一部分的研究探索是至关重要的。

总的来说，尽管过去30年人们对于神经母细胞瘤的探索已得到了巨大进展，仍有例如神经母细胞瘤中不同类型的细胞相互转换的机制、疾病异质性来源、针对肿瘤组织中间充质类型细胞药物的开发、复发及高危患者的有效治疗措施等一系列问题亟待解决。此外，在快速发展的研究技术中葆有对研究方法科学性的审视，将深入了解交感肾上腺组织的分化、不同谱系细胞之间的关系寓于临床实践中，也是至关重要的。

撰文

责编

制作

排版 | 车洁 校对 | uu