JIC｜单细胞转录组测序揭示神经母细胞瘤免疫抑制性微环境

撰文 | 郑诗蔚 责编 | 谷国灿

神经母细胞瘤是一种起源于交感神经系统的胚胎性肿瘤，好发于2岁以下的婴幼儿，是儿童期最常见的颅外实体瘤。神经母细胞瘤具有临床异质性，肿瘤可自发消退，也可表现为侵袭性生长和转移性播散。根据其临床生物学行为，可以将患者分为低危组、中危组和高危组，从而采取不同的治疗手段。患者的预后与危险分层相关，对于高危组患者，目前5年生存率仍低于40%。

肿瘤的发生发展依赖于肿瘤微环境，了解微环境的构成，特别是免疫微环境的构成，对于神经母细胞瘤的治疗可以起到重要的启示性作用。尽管当前神经母细胞瘤免疫微环境的研究已取得初步进展，但对其细胞构成的认识还不够全面。单细胞转录组测序技术能够在单细胞水平对转录组进行高通量测序分析，在研究肿瘤微环境的细胞构成上具有显著优势。借助于这一技术，有望揭开神经母细胞瘤免疫微环境的神秘面纱，进而有针对性地对患者进行治疗。

2022年8月5日，来自法国居里研究所的Ana Costa, Cécile Thirant, Amira Kramdi等人在Journal for ImmunoTherapy of Cancer杂志上发表题为Single-cell transcriptomics reveals shared immunosuppressive landscapes of mouse and human neuroblastoma的文章。在这项研究中，研究人员使用单细胞RNA测序，分析了小鼠和人类神经母细胞瘤微环境成分的转录组，通过聚类分析揭示了肿瘤微环境中免疫细胞的构成，并通过流式细胞技术和功能实验对相关的免疫细胞进行了验证。该研究为神经母细胞瘤的研究提供了宝贵的参考资料，并通过描述微环境的免疫成分为未来提供了可能的治疗方向。

该研究中使用的神经母细胞瘤小鼠模型为TH-MYCN转基因小鼠，研究人员首先将小鼠肿瘤样本分解成单细胞悬液，然后用10x Genomics平台进行细胞分选、用NovaSeq进行RNA测序。在完成单个样本数据的质控后，对筛选后的三个样本的单细胞基因表达数据进行整合分析，共获得5650个细胞，每个肿瘤样本平均含有1883个细胞。在用Seurat工具做细胞聚类和细胞类别标记后，研究人员发现：在小鼠神经母细胞瘤的微环境中，除Phox2b+肿瘤细胞外，共有八种细胞类型，包括Cd68+巨噬细胞，Cd14+髓系细胞，Cd79a+B细胞，Cd3e+T细胞，Irf8+树突细胞，Nkg7+NK细胞，以及Fn1+癌症相关成纤维细胞和vWF+内皮细胞。其中巨噬细胞和Cd14+髓系细胞占比最大，这一结果也被免疫组化以及流式细胞分析结果验证。

UMAP图（左）显示小鼠中单细胞聚类结果和微环境细胞组成，饼图显示不同细胞成分在微环境中的占比

聚类分析结果显示，在小鼠神经母细胞瘤的微环境中存在三种巨噬细胞群体，根据其上调表达基因的不同，这三种巨噬细胞被称作Pecam1+，Ccr2+和Apoe+巨噬细胞。进一步分析显示，Apoe+巨噬细胞的基因表达和传统M2巨噬细胞相似，而另外两种巨噬细胞与在其他研究中发现的巨噬细胞群体没有太多相似之处，这一结果表明不同肿瘤附近的巨噬细胞具有高度异质性。

对于被标记为Cd14+的髓系细胞，研究人员发现这些细胞上调了中性粒细胞的标记基因（S100a8，S100a9，Mmp9），同时还与多型核中性粒细胞-髓源抑制性细胞（PMN-MDSC）的基因表型重合，这一表型提示与免疫抑制相关。此外，Cd14+的髓系细胞还上调与免疫抑制相关的基因（Il1b，Arg2）。免疫组化和流式细胞结果证实，小鼠神经母细胞瘤的微环境中的确存在PMN-MDSC和M-MDSC（单核细胞-MDSC）两种亚型，分别被CD11b+Ly6G+Ly6Clow和CD11b+Ly6G-Ly6Chigh标记。

随后，研究人员对10例神经母细胞瘤患者（其中初诊和复发患者各5例，伴或不伴有MYCN基因扩增患者各5例）的活检样本进行分析，这些样本共包含了20296个细胞。除了PHOX2B+、GATA3+肿瘤细胞和内皮细胞外，聚类分析还发现了CD68+巨噬细胞（包含四个亚型），CD3D+T细胞，NKG7+NK细胞，MS4A1+B细胞，CD1C+树突细胞，CD14+髓系细胞，CD14int+ FCGR3A+非传统髓系细胞，以及S100A8+ S100A9+ FCGR3B+髓源抑制性细胞（MDSC），其中MDSC细胞同时还上调了中性粒细胞以及PMN-MDSC的标记基因。

和小鼠的分析结果相近的是，CD68+ APOE+巨噬细胞同样与M2巨噬细胞的基因表达相似，且不同巨噬细胞亚型之间存在非常显著的基因表达差异。运用scVelo工具对巨噬细胞的转化轨迹进行分析后，研究人员还发现，APOE+CSF1Rmed与APOE+CSF1Rlow均来自于APOE+CSF1R+巨噬细胞。而对于MDSC细胞，统计结果显示这种细胞的占比在伴有MYCN基因扩增和复发病例中的比例更高，说明MDSC可能与神经母细胞瘤的复发和晚期疾病相关。

UMAP图显示神经母细胞瘤患者样本中单细胞聚类结果和微环境细胞组成

在获取了小鼠模型和神经母细胞瘤患者样本的分析结果后，研究人员接下来对两个物种的数据进行了更详细的对比。结果显示小鼠和人的多种细胞存在基因表达的极大重合，甚至包括MDSC细胞，但两个物种的巨噬细胞的亚型关系则更复杂，说明巨噬细胞可能存在与物种相关的特定基因表达模式。此外，由于患者中肿瘤浸润T细胞普遍上调了免疫抑制受体（包括LAG3，TIGIT，CTLA4，HAVCR2/TIM3和PDCD1/PD-L1）的表达，研究人员推测MDSC的存在可能是造成T细胞活性抑制的原因。为了验证这一猜想，研究人员将从野生型小鼠中提取并激活的T细胞与从神经母细胞瘤模型小鼠中提取的PMN-MDSC（CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clow）或M-MDSC（CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chigh ）细胞一同孵化，发现CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖被显著抑制。这证实了MDSC对T细胞的抑制作用，同时提示了在神经母细胞瘤的人类样本中，MDSC细胞可能会发挥相似的功能。

小鼠模型中PMN-MDSC和M-MDSC抑制T细胞增殖的功能验证

总的来说，这一研究运用单细胞RNA测序，结合免疫组化、流式细胞以及功能验证实验，对小鼠和人的神经母细胞瘤微环境组成做了非常详尽的分析。由于研究人员并未像传统实验一样，对RNA测序的样本进行事先筛选，聚类分析的结果代表了所有肿瘤微环境中可能存在的细胞类型，并能精确还原不同细胞在微环境中所占的比例。通过对不同细胞基因表达的描述，以及对巨噬细胞和MDSC细胞功能的着重特写，这项研究为将来神经母细胞瘤的针对性治疗提供了新的方向。

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