精准插入大段DNA，新一代基因编辑工具问世

▎药明康德内容团队编辑

通过对人类基因组的修改，一劳永逸地治疗遗传疾病，是许多科学家的梦想。而基于CRISPR-Cas9而开发的一系列基因编辑系统的问世，让人们看到将梦想变为现实的希望。目前基于CRISPR-Cas9系统的体内基因编辑疗法已经获得

概念验证

，随后出现的单碱基编辑系统也已经

进入临床开发阶段

。然而，这些系统在人类基因组中精准插入大段DNA方面仍然具有不少局限性。近日，加州大学伯克利分校和斯坦福大学的科学家组成的研究团队，发现了一系列全新的大丝氨酸重组酶（large serine recombinases，LSR）。这些LSR可以将超过7 kb的大型DNA片段精准地插入人类基因组，为基因组工程化研究，以及创新疗法的开发提供了一整套新工具！

导致遗传病的原因有很多，有的时候只是编码蛋白的基因上的一个“字母”出错了，而其它情况下，可能大段的基因片段出现缺失。基因编辑可以通过精准纠正单碱基突变，或者提供缺失基因的替代拷贝，恢复细胞功能并且治疗疾病。

早期CRISPR-Cas9系统能够在人类基因组中特定位置上精准地切断双链DNA，这会激活细胞的DNA修复系统，如果同时添加正确的DNA模板，细胞可能会利用称为同源重组的机制将模板添加到基因组中。

然而这种基因编辑手段并不可靠，有时候会导致双链DNA断裂（DSB）部位附近的碱基缺失，或者产生随机DNA片段插入。新一代碱基编辑系统能够更精准地改变单个碱基，但是在添加大型DNA片段上仍然有局限性。

“我们希望开发一种能够将大型DNA片段添加到人类基因组中的简单工具。它不需要产生DNA双链断裂，也不需要依靠细胞的DNA修复机制。”论文的通讯作者之一，伯克利大学的研究员，新近成立的Arc研究所（Arc Institute）的联合创始人Patrick Hsu博士说，“我们的猜测是大自然已经进化出解决这些挑战的工具，它们就藏在噬菌体和其它移动遗传原件（mobile genetic elements）中。“

▲Patrick Hsu博士（图片来源：Arc研究所）

Hsu博士曾经师从CRISPR领域先驱张锋博士，在开发最初的CRISPR基因编辑系统中做出了重要贡献。在这项研究中，他的团队和斯坦福大学的科学家们合作，对噬菌体中存在的LSRs进行了研究。LSR是噬菌体携带的一种整合酶，它们通过识别细菌基因组和噬菌体DNA片段上的特定序列，将大段DNA序列整合到细菌的基因组中。它的一个优点是可整合包含上千个碱基对的DNA序列，可以容纳一个完整的人类基因。“我们认为LSR具有将突变基因的功能性拷贝递送到基因组中，恢复细胞功能的潜力。”Hsu博士说。

▲LSR可以介导大段DNA精准整合到细菌的基因组中（图片来源：参考资料[3]）

不过，此前只有少数几种LSRs被科学家们用于基因组编辑，限制它们应用的主要原因之一是整合效率低，只有不到10%细胞的基因组得到修改。与其进一步改造已有的LSRs，这支联合团队另辟蹊径，决定寻找大自然噬菌体中的其它LSRs。在细菌和噬菌体漫长的进化路程中，噬菌体进化出上千种不同的LSRs，它们可能提供更有效的基因编辑工具。

研究人员设计了一种算法，利用计算机系统的搜索噬菌体和细菌的DNA序列，从中发现新LSR种类的信号。利用这一算法，研究人员发现了超过6000种独特的LSRs，将已知的LSRs数目扩展了超过100倍！

对这些LSRs的进一步研究发现，它们具有不同的特征，有些LSRs只能识别细菌基因组上的特定序列，并且将大型DNA片段整合到包含特定序列的位点中。这些序列在人类基因组中并不存在。不过只要在人类基因组中人工引入这些被称为“着陆区”（landing pad）的特定序列，就能够精准引入大型DNA片段。而且，有些新发现的LSRs具有更好的整合效果，在实验中，新型的LSRs可以将超过7 kb的DNA片段，以40~75%的效率，整合到细胞的基因组中。

图片来源：123RF

另外一类LSRs识别的序列已经在人类基因组中存在。这让它们可以直接用于在人类基因组中引入转基因，实现基因工程改造。研究人员指出，这些LSRs可以用于CAR-T细胞的生产，与目前使用慢病毒介导的转基因递送相比，LSRs介导的转基因整合可以将转基因整合到确定的基因组位点，避免慢病毒介导转基因递送的随机性。而且由于不同的LSRs识别的“着陆区”序列不同，使用不同的LSRs可以在同一个细胞里引入多个不同的转基因，进一步增强CAR-T细胞疗法的功能。

最终，研究人员确认了超过60种经过实验验证，可以在人类细胞中插入大型DNA片段的LSRs。这些LSRs不需要任何宿主细胞内蛋白的参与，不需要指导RNA的引导，而且它们的平均分子量只有Cas9酶的一半，更容易递送进入细胞。

Arc研究所的团队目前在开发靶向人类基因组的LSRs，它们只会在人类基因组的一处特异性导入具有治疗效果的转基因。科学家的目标是开发一种DNA整合平台，不论需要整合的基因是什么，都能够安全、高效地将它们整合到人类基因组中一个独特的位点。“这将提供一种‘通用型’的基因疗法递送策略，并且更容易规模化生产。”Hsu博士表示。

从CRISPR基因编辑工具的问世，到单碱基编辑系统，先导编辑系统的诞生，以及新一代Cas核酸酶的发现，基因编辑工具箱中的工具不断增加，让更精准、更有效地修改人类基因组成为可能。创新LSRs的发现，为基因编辑的工具箱又增添了一种新工具，期待科学的突破尽早发挥基因编辑的全部潜力，转化为造福患者的治愈性疗法。

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