抗体测序为抗体治疗研究提供新路径

在面对外界形形色色的病原时，我们体内种类繁多的天然功能抗体组成了一道强有力的免疫防线保卫了我们的健康。时至今日，随着免疫学和分子生物学技术的发展，研究人员已经可以在体外分离、纯化制备抗体，并直接促使了抗体药物的诞生。

抗体药物

自从1986年第一个治疗性抗体莫罗单抗-CD3（Muromonab-CD3）进入临床应用以来，相继已经有一百多种治疗性抗体药物进入临床应用，且每年都有新的抗体药物处于研发和上市过程中。

图1. 常见抗体药物。包括CD3单抗，用于治疗多种癌症；英夫利西单抗(Infliximab) ，用于治疗免疫系统紊乱如克罗恩病；阿达木单抗（Adalimumab），用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎； 依那西普单抗(Etanercept)，用于治疗类风湿关节炎[1]。

随着技术的发展，抗体筛选和发现的常用技术有噬菌体展示技术，转基因鼠杂交瘤技术和单个B细胞技术。噬菌体展示技术实现了蛋白/多肽基因型与表型的统一，利用已有的基因片段可以快速的筛选得到所需抗体，但是其对文库的依赖度比较高，无法应对抗体种类的多样性和复杂性。转基因鼠杂交瘤技术不需要经过传统的分子生物学表达重组抗体步骤，只需经过动物免疫、细胞培养和细胞融合、小鼠腹水制备和单抗纯化就可以完成目标抗体制备，但其仍然存在操作复杂，难度大，成功率低等缺点。单个B细胞技术具有效率高、人源性全、基因多样性丰富等优点。然而，迄今为止，单个B细胞抗体制备技术的应用潜力尚未发挥出来。单个B细胞抗体制备技术仍受到一些实际条件的限制，如高通量PCR抗体基因扩增技术不完善、某些靶抗原制备困难、对合适的人类供体需求量大等。而依赖于蛋白质从头测序的抗体发现技术操作简便快捷，不依赖任何抗体文库，并且可以应对各种各样的抗体检测，因而越来越受到抗体药物发现及研发者的关注和青睐。

图2.（左）噬菌体展示技术筛选单抗[2]，可快速筛选得到目标抗体但其对文库的依赖度比较高，无法应对抗体种类的多样性和复杂性；（右）转基因鼠杂交瘤技术，不需要经过传统的分子生物学表达重组抗体步骤，但其仍然存在操作复杂，难度大，成功率低等缺点。

蛋白质测序

抗体序列的发现有赖于基因测序和蛋白质测序。与基因测序相比，蛋白质测序产生的随机匹配要少得多，更有利于新抗体序列的发现。在蛋白质测序方法中，目前常用的有三种方法：基于Edman降解法的测序、肽谱分析和蛋白质从头测序（De novo sequencing）。其中，由于蛋白质从头测序具有不依赖任何蛋白质数据库，可以对任何未知蛋白质进行全长测序的优势而成为获得蛋白序列的首选技术。

图3.三种蛋白质测序方法对比[3]。Edman降解法只能对N末端几十个氨基酸序列进行测定，肽谱分析需要依赖已有蛋白数据库，而蛋白质从头测序（De novo sequencing）可以不依赖任何蛋白质数据库，对未知蛋白质从头测序。

目前，基于蛋白质从头测序发展而来的抗体测序技术已逐步受到包括基础研究和抗体药物开发人员的关注。快序生物的抗体发现平台可以直接高效地发现在免疫系统发挥作用且具高亲和力的天然抗体，便于生产重组抗体，为抗体研发提供全新途径。

图4.快序抗体发现平台

快序生物抗体发现平台仅仅需要1 mg抗原亲和纯化的多克隆抗体，或3-5 mL血液的样品量，再利用多种酶将包含多种抗体的蛋白样本水解为短肽，进一步通过使用高精度质谱仪(Thermo Orbitrap Fusion)进行检测，以及从头测序算法将串联质谱数据变为短肽序列，最终将短肽序列组装回完整的高质量的抗体蛋白质序列。

快序生物自主研发的蛋白从头测序技术突破了样品的限制，可以在复杂样品中获得蛋白序列，打破传统蛋白组学的数据库依赖性，真正实现了对蛋白质的从头测序。其中，上海快序生物科技有限公司在其20多年的技术积累上，对抗体测序技术进行了持续优化和升级，开发出了更加简易、迅速和准确的抗体测序平台。快序生物的蛋白从头测序技术平台的技术优势具体表现为：

1、更简易，突破样品局限

运用我们开发的独特蛋白从头测序技术可在复杂样品中获得蛋白序列，打破传统蛋白组学的数据库依赖性，真正实现了对蛋白质的从头测序。

2、更迅速，高通量测序获取信息

通过高通量测序在工作中更快地获取信息，并识别其他方法无法找到的特殊高质量分子，大大缩减获取蛋白测序结果的时间。

3、更严谨，百分百确保序列精度

该核心技术，确保了每一个氨基酸的正确性和全抗体的序列精度，抗体测序技术可确保序列的每个位点的氨基酸有超过十种不同的肽段支持，并在氨基酸水平上进行质量控制，确保每个氨基酸在质谱里有强的离子片段峰证据，可在抗体测序中准确区分Leu/Ile残基。

快序抗体发现平台应用场景

基于以上特点和优势，快序生物的抗体发现服务已经在众多领域得到了充分应用。这些实际应用更加凸显了快序生物在抗体发现方面的专业性和行业领先性。

1、肿瘤中新的天然抗体发现：靶向治疗已经在许多肿瘤临床治疗中进行应用，而靶向治疗的基础就是对于肿瘤中各种天然抗体的发现。2022年发表于Cell的一篇题为《Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors》[4]的研究中提出了一种利用患者体内天然抗体治疗肿瘤的新方法。这种方法克服了目前依赖于已有蛋白序列开发靶向药的缺点，为开发新型靶向药提供了技术支持。而利用快序生物的蛋白发现平台，研究人员可以快速对于体内不同的天然抗体进行快速鉴定和开发，从而加速药物研发进程。

2、前文中我们已经提到抗体药物目前已经成为生物医药里的重要组成部分。而在面向未来的抗体药物研发中，使用患者自身来源的天然抗体制备抗体药物已成为一个重要的研究方向。2022年在国际顶级期刊Science Advances上发表的一篇题为《Rapid, site-specific labeling of “off-the-shelf” and native serum autoantibodies with T cell–redirecting domains》的研究性文章中，研究人员开发了一种可以将 T 细胞重定向结构域特异性共价连接到任何现成的人免疫球蛋白G（IgG）或血清中分离的天然 IgG，只需数小时即可生成双特异性抗体的技术。该技术可以使用癌症患者自身的抗体来发现和治疗自身癌症，从而实现精准医疗和个性化治疗。而利用快序生物的抗体发现平台，我们可以快速准确的对生物体内的新抗体进行测序鉴定，从而将上述实验室成果快速推进至临床，加快新型抗体药物研发速度[5]。

3、自身免疫性疾病治疗性抗体的研发：许多自身免疫性疾病的发病是因为致病性免疫球蛋白G（IgG）抗体的产生，随后形成的免疫复合物从而对正常的细胞和组织产生毒害和攻击作用，危害人类健康。而通过快序生物的抗体发现平台，不依赖于已有的蛋白数据库，可以迅速的对患者血液中的抗体进行分离检测，从而开发出有针对性的治疗抗体，从而开发针对性的临床治疗方案。

4、干预后免疫应答的识别：通过快序生物的抗体测序平台可以对免疫应答中产生的天然后的抗体水平进行快速评估和干预。

5、多抗转化为单抗或单抗混合物：根据抗体识别抗原表位的数量是否单一，抗体被分为单抗而多抗，而单抗的靶向治疗效果优于多抗，是临床开发抗体药物的首选。然而，单抗的开发过程耗时耗力，且技术难度较大。而在快速生物抗体发现平台的支持下，可以将方便制备的多抗快速进行分析检测，从而转化为特异性单抗或单抗混合物，加快了单抗的制备过程。

总结

随着人类医疗卫生水平的不断增加，抗体已经在临床诊疗中发挥了越来越重要的作用，各种抗体生物制品的研发也是生物医药领域的重要组成部分。然而，耗时耗力技术难度大限制了抗体制品的制备和研发。基于此，快序生物打造的抗体发现品平台，不仅突破了样品种类和数量的限制，还提高了速度和精准度，极大降低了抗体制品的研发周期。

选择快序生物抗体发现平台，让抗体研发不再“卡脖子”！

参考文献：

[1] Smith, Susan L. "Ten years of Orthoclone OKT3 (muromonab-CD3): a review." Journal of Transplant Coordination 6.3 (1996): 109-121.

[2] Diebolder, P., & Krawczyk, A. (2017). Detailed Protocols for the Selection of Antiviral Human Antibodies from Combinatorial Immune Phage Display Libraries. In (Ed.), Antibody Engineering. IntechOpen

[3] Janin-Bussat, Marie-Claire, et al. "Characterization of antibody drug conjugate positional isomers at cysteine residues by peptide mapping LC–MS analysis."Journal of Chromatography B 981 (2015): 9-13.

[4] Roei D. Mazor et al, Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors, Cell (2022).

[5] Zappala F, Higbee-Dempsey E, Jang B, et al. Rapid, site-specific labeling of "off-the-shelf" and native serum autoantibodies with T cell-redirecting domains. Sci Adv. 2022.

[6] Muñoz-Durango N, Pizarro-Ortega MS, Rey-Jurado E, Díaz FE, Bueno SM, Kalergis AM. Patterns of antibody response during natural hRSV infection: insights for the development of new antibody-based therapies. Expert Opin Investig Drugs. 2018.