《自然·癌症》：中国科学家发现“癌王”对“合成致死”敏感的标志！

作为最常见的RNA修饰之一，RNA腺嘌呤碱基在氮6位置的甲基化（简称m6A）自2011年重新进入科研人员视野以来，其研究热度一直不减[1]。而作为第二个被发现的RNA m6A甲基转移酶[2-3]，METTL16最近也成为了生命科学的研究热点[4-5]。

近日，由美国妙佑医疗国际（Mayo Clinic）肿瘤科的楼振昆、上海同济大学医学院的袁健，以及华中科技大学同济医学院附属协和医院的陶凯雄领衔的研究团队，在《自然·癌症》杂志上发表关于METTL16功能的最新研究成果[6]。

他们发现，METTL16能够通过其结合的RNA，以一种不依赖于其甲基转移酶功能的方式，和同源重组修复关键酶MRE11相互作用并抑制其核酸外切酶活性，进而抑制DNA的同源重组修复。在DNA损伤的情况下，METTL16可以被ATM激酶磷酸化，导致其构象变化，RNA结合能力下降，进而导致MER11不再受到METTL16的抑制。

反映到疾病模型中，比如胰腺癌，他们发现过表达METTL16能提高胰腺癌细胞对PARP抑制剂奥拉帕利的敏感性，特别是在与化疗药吉西他滨联合使用的情况下。

奥拉帕利在同源重组缺陷型胰腺癌中已获美国FDA批准[7]。但是，仅有大约10%的胰腺癌患者带有同源重组缺陷型突变，大部分胰腺癌患者都无缘该疗法。因此，METTL16具有抑制DNA同源重组修复功能的这一发现，对PARP抑制剂在不带有同源重组缺陷型突变的胰腺癌患者中的使用具有重要意义。

论文首页截图

接下来，就让我们来看看楼振昆、袁健，以及陶凯雄团队是如何展开这项研究的。

受启发于有关RNA m6A修饰在DNA修复功能方面的研究[8-9]，研究人员决定探索m6A修饰酶（METTL3-METTL14，METTL16）在胰腺癌DNA损伤中扮演的角色。

通过对胰腺癌组织微阵列样本中DNA双链断裂（DSB）的水平和METTL3-METTL14，METTL16的表达水平进行分析，研究人员发现，高表达METTL16的样本中DSB水平较高。另外，DSB修复报告系统（DR-GFP/EJ5-GFP）的结果显示，在HEK293T细胞中敲低METTL16可以显著增加同源重组（HDR）介导的DNA修复效率。考虑到METTL16对DNA损伤修复功能的影响尚未有报道，研究人员决定对其进行进一步探索。

胰腺癌组织中METTL16表达水平与DSB水平呈正相关

研究人员首先构建了敲除METTL16和敲除后重新表达METTL16的细胞系，并对辐射诱导产生的DSB水平进行评估。

结果显示，辐射处理细胞8小时后，与野生型细胞相比，METTL16缺陷型（KO）细胞中的γ-H2AX（DSB标志物）染色水平明显降低。同时，辐射处理4小时后，KO的DNA拖尾现象与野生型相比有明显改善。而重新表达METTL16后，γ-H2AX水平和DNA拖尾现象的变化都被逆转了。

这些结果说明，METTL16对DNA修复有抑制作用。

敲除METTL16可以增强DNA修复，降低DSB水平

蛋白序列分析结果显示，METTL16存在着两个潜在的ATM/ATR（DNA修复相关激酶）磷酸化位点（Ser419和Ser455）。因此，研究人员猜测METTL16可能受ATM/ATR调控。结果确实如此。通过对这两个位点的磷酸化状态进行分析、构建位点突变模型等方法，研究者们发现ATM可以磷酸化METTL16上Ser419位点，而这会降低其对HDR的抑制作用。

ATM可以通过磷酸化METTL16来弱化其对HR修复的抑制作用

HDR修复DNA双链断裂主要有三大步骤，链末端切除（end resection）、3’-单链入侵同源模板链（strand invasion）、Holliday结的分解（resolution of Holliday Junction）。那么，METTL16会影响HDR的哪个步骤呢？

研究者们发现，辐射处理2h后，与METTL16正常表达的细胞相比，METTL16敲除的细胞中蛋白RPA32和RAD51水平显著增加，且重新表达METTL16能逆转这些变化。

蛋白RPA32是一种单链DNA结合蛋白，与DNA复制过程中或DNA损伤情况下产生的3’单链结合，从而起到稳定单链的作用，而RPA32染色水平的增加则意味着细胞中3’-单链的增加。这提示到，METTL16会抑制链末端切除。

另外，免疫共沉淀实验结果显示，METTL16和链末端切除关键复合物MRN-CtIP中的MRE11存在相互作用，且辐射处理能减少这种相互作用。

这些结果说明，METTL16能够通过与MRE11互作，来抑制HDR修复DNA过程中的链末端切除。

METTL16通过与MRE11的相互作用来抑制HDR中的链末端切除步骤

随之而来的问题是，METTL16是怎么和MRE11相互作用的呢？

研究人员从MRE11上存在的两个DNA结合域以及METTL16存在的四个RNA结合基序入手，通过DNase/RNase处理以及一系列的截短突变实验，证明METTL16与MRE11的相互作用是通过与这两者相结合的RNA实现的。另外，胞外核酸酶实验结果显示， METTL16-RNA复合体与MRE11结合后，会抑制MRE11核酸酶活性。

METTL16通过RNA和MRE11产生相互作用并抑制后者的核酸酶活性

开头提到，METTL16的主要功能是对RNA进行m6A修饰。然而研究者们发现，和野生型METTL16相比，丧失甲基转移酶活性的METTL16突变体（F187G），依然能够与MRE11相互作用，抑制链末端切除，进而抑制HDR效率。也就是说，METTL16和MRE11的相互作用并不依赖于METTL16的甲基转移酶活性。

另外，介导METTL16和MRE11相互作用的RNA是否存在m6A修饰，对这种相互作用也没有影响。反倒是ATM对METTL16的磷酸化，会降低其与RNA结合能力，进而减少METTL16和MRE11的相互作用。

METTL16与RNA的结合，以及与MRE11的相互作用并不依赖METTL16的甲基转移酶活性或者RNA的m6A修饰

至此，研究人员已经确定了METTL16在HDR中扮演的角色：DNA损伤激活ATM后，ATM磷酸化METTL16并导致其构象改变，使得RNA从METTL16上原本的结合态分离出来，进而导致METTL16与MRE11的相互作用减少，MRE11从复合体中释放出来后参与HDR，修复DNA损伤。

考虑到METTL16对HDR的抑制作用，以及PARP抑制剂对HDR缺陷型肿瘤合成致死的特性，研究人员分析了PARP抑制剂奥拉帕利对表达不同水平METTL16的BRCA1/2野生型胰腺癌细胞的杀伤效果。

结果显示，高表达METTL16的细胞系对奥拉帕利更敏感，在高表达METTL16背景下敲除METTL16会降低细胞对奥拉帕利的敏感性，在低表达METTL16背景下过表达METTL16则会增加细胞对奥拉帕利的敏感性。METTL16表达水平与对奥拉帕利的敏感性的这种正相关在小鼠胰腺癌模型中也得到了证实。

胰腺癌细胞和肿瘤中METTL16的表达水平与对奥拉帕利的敏感性呈正相关

最后，研究人员评估了METTL16表达水平对胰腺癌患者生存期，以及对胰腺癌临床疗法效果的影响。

结果显示，胰腺癌患者的METTL16表达水平与其生存期呈正相关。另外，动物模型结果显示，高表达METTL16的肿瘤对吉西他滨单药、奥拉帕利单药更敏感，肿瘤发展减缓。在高表达METTL16的肿瘤中，吉西他滨+奥拉帕利的联合使用可以使肿瘤衰退，显著延长小鼠生存期。

高表达METTL16的胰腺癌患者具有较好生存期，也预示着对胰腺癌治疗药物更高的敏感性

总的来说，这项研究发现了METTL16的一项全新功能，即METTL16会通过与DNA同源重组关键酶MRE11的相互作用来抑制DNA的同源重组修复。

同时，该研究揭示了METTL16的水平是一个潜在的胰腺癌预后指标，且吉西他滨+奥拉帕利的联合使用可能是治疗高表达METTL16胰腺癌的有效策略。

参考文献：

[1] Jiang X, Liu B, Nie Z, et al. The role of m6A modification in the biological functions and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):74. Published 2021 Feb 21. doi:10.1038/s41392-020-00450-x

[2] Warda AS, Kretschmer J, Hackert P, et al. Human METTL16 is a N6-methyladenosine (m6A) methyltransferase that targets pre-mRNAs and various non-coding RNAs. EMBO Rep. 2017;18(11):2004-2014. doi:10.15252/embr.201744940

[3] Pendleton KE, Chen B, Liu K, et al. The U6 snRNA m6A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 2017;169(5):824-835.e14. doi:10.1016/j.cell.2017.05.003

[4] Su R, Dong L, Li Y, et al. METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis. Nat Cell Biol. 2022;24(2):205-216. doi:10.1038/s41556-021-00835-2

[5] Satterwhite ER, Mansfield KD. RNA methyltransferase METTL16: Targets and function. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022;13(2):e1681. doi:10.1002/wrna.1681

[6] Zeng X, Zhao F, Cui G, et al. METTL16 antagonizes MRE11-mediated DNA end resection and confers synthetic lethality to PARP inhibition in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat Cancer. 2022;3(9):1088-1104. doi:10.1038/s43018-022-00429-3

[7] Golan T, Hammel P, Reni M, et al. Maintenance Olaparib for Germline BRCA-Mutated Metastatic Pancreatic Cancer. N Engl J Med. 2019;381(4):317-327. doi:10.1056/NEJMoa1903387

[8] Zhang C, Chen L, Peng D, et al. METTL3 and N6-Methyladenosine Promote Homologous Recombination-Mediated Repair of DSBs by Modulating DNA-RNA Hybrid Accumulation. Mol Cell. 2020;79(3):425-442.e7. doi:10.1016/j.molcel.2020.06.017

[9] Yu F, Wei J, Cui X, et al. Post-translational modification of RNA m6A demethylase ALKBH5 regulates ROS-induced DNA damage response. Nucleic Acids Res. 2021;49(10):5779-5797. doi:10.1093/nar/gkab415