郑州大学张开翔/高华团队开发新型CRISPR检测平台，点亮血浆外泌体中的癌症生物标志物miRNA

大多数癌症诊断技术依赖于令人不舒服和侵入性的程序，如组织活检、内窥镜检查或X光检查。血液样本检测可能是一个相对更好的选择，但目前也只有少数疾病可以通过血液检测来诊断。

外泌体（exosome），是细胞分泌产生的一种囊泡型天然生物颗粒，其中携带了许多功能性生物分子，包括DNA、miRNA、mRNA、circRNA、lncRNA、脂质和蛋白质等，参与生理活动和病理变化中的细胞间通讯。外泌体为了解其来源的细胞的生理状态提供了一扇窗口，因为它们携带的货物在不同病理条件下有所不同，其中，异常的miRNA水平与包括癌症在内的多种疾病相关。

近日，郑州大学药学院张开翔、基础医学院高华等人在 ACS Sensors 期刊发表了题为：Highly Effective Detection of Exosomal miRNAs in Plasma Using Liposome-Mediated Transfection CRISPR/Cas13a 的研究论文。

该研究开发了一种脂质体介导的膜融合CRISPR平台——MFS-CRISPR，该平台使用CRISPR-Cas13a来检测血浆外泌体中微量的癌症相关miRNAs，能够检测低至1.2× 103 particles/mL的外泌体miR-21，并有效区分恶性和良性样本。

这项新技术在癌症诊断和治疗监测方面具有很好的临床潜力，该方法简单、快速、灵敏，有望推动微创液体活检技术的发展。

癌细胞独特的胞内环境可以通过miRNA等生物标志物反映在其外泌体中。miRNA是一类由细胞的内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞中发挥调控作用。

外泌体miRNA在癌症生物学中发挥着关键作用，可作为癌症诊断的潜在生物标志物。然而，外泌体中miRNA的水平非常低，因此，以一种易于操作的方式识别、检测和量化疾病相关外泌体miRNA仍然存在挑战。

此前，已有研究开发了基于CRISPR基因编辑的检测系统来分析细胞外囊泡中的RNA和蛋白质，例如用于检测细胞外囊泡中SARS-CoV-2 RNA的CRISPR-Cas12a系统，以及检测肿瘤细胞来源的细胞外囊泡中蛋白质的CRISPR-Cas12a系统。

在这项最新研究中，研究团队希望开发出一种新方法来检测微量的癌症相关外泌体miRNA，该检测方法基于CRISPR-Cas13a系统，该系统具有独特的RNA酶活性，而而且灵敏、可靠和有效。研究团队设计了一个CRISPR-Cas13a系统来切割荧光基团和淬灭剂标记的报告分子，然后将其包装到脂质体中，这一脂质体相当于人造版外泌体，使用脂质体介导的膜融合（MFS）策略，将CRISPR-Cas13a系统转染到外泌体中。

由于Cas13a具有独特的RNA酶（RNase）活性，RNA引导下Cas13a的反式切割活性可以裂解荧光团和淬灭剂标记的报告细胞，导致靶标RNA触发RNA酶激活后荧光增强。

当脂质体和外泌体融合在一起时，如果外泌体中存在靶标miRNA序列，CRISPR-Cas13a就会识别并结合到靶标miRNA，然后激活反式切割活性，有效切割并产生放大的荧光信号。

MFS-CRISPR平台的建立

在这项研究中，研究团队以miR-21为靶标进行了验证实验，miR-21是一种与包括乳腺癌在内的几种疾病相关的miRNA。实验结果显示，MFS-CRISPR技术平台可以成功地在类似序列的混合物中检测到miR-21，并且具有高灵敏度。研究团队还在一组来自健康人类细胞的外泌体和来自乳腺癌细胞的外泌体上测试了该方法，该方法能够将癌症相关的外泌体与健康细胞来源的外泌体区分开来，这表明该平台可用于癌症诊断。

MFS-CRISPR平台有以下优点：1）使用脂质体介导的膜融合策略，可以将CRISPR-Cas13a与外泌体融合，直接测量血浆中外泌体miRNA，避免了耗时的提取步骤；2）使用CRISPR-Cas13a荧光信号放大方法，显著提高检测灵敏性；3）MFS-CRISPR平台无需提取RNA，避免了RNA降解和污染的发生。

研究团队表示，基于CRISPR-Cas13a的MFS-CRISPR平台，可以直接检测血液样本并成功区分来自乳腺癌患者和健康捐赠者的临床样本，从临床样本荧光强度检测结果来看，乳腺癌患者与健康捐赠者的miR-21表达差异显著。因此，通过MFS-CRISPR平台检测分析血液样本，有望实现更快、更简便的癌症诊断和监测。