为新一代ADC药物奠定基础，刘涛/杨兴团队开发蛋白质多功能修饰平台

治疗性蛋白质，比如抗体、激素、干扰素、白细胞介素、酶等等在各类疾病治疗领域发挥着重要的作用，但是这些天然蛋白由于成药性的缺陷，如疗效差，半衰期短，系统性用药毒性大，免疫原性高等问题，难以满足当前科研和临床的需求。对蛋白质进行化学修饰逐渐成为一种重要的对其成药性进行改造的手段。

近几十年以来，随着蛋白质工程和基因工程技术的不断发展，涌现出来了众多的蛋白质偶联修饰策略。但是这些策略往往局限于对蛋白质的单一化修饰，随着对疾病的深入研究，对发病机制不断趋于复杂化的认识以及对精准个性化医疗的需要，蛋白质的单一修饰已经不能够满足当前需求，比如偶联单一类型抗癌药物的ADC仍然存在疗效低、耐药等问题。因此蛋白质的双修饰或者多修饰在实现多功能蛋白药物的开发方面变得尤为重要。目前实现蛋白质多修饰，尤其是定点多修饰策略研究相对较少，是亟待解决的科学难题。

北京大学药学院刘涛和北京大学第一医院杨兴作为共同通讯作者在 Nature Communications 期刊在线发表了题为：Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates 的研究论文。

该工作开发了一套双功能非天然氨基酸位点特异性引入到蛋白质，进而实现蛋白质多功能修饰的平台，可以轻松获得高产量的蛋白质双偶联物和多偶联物。该技术为发展新一代的抗体药物偶联药物（ADC）及发展肿瘤诊疗一体化方案奠定了重要的技术基础。

点击化学和生物正交化学于2022年获得诺贝尔化学奖，在蛋白质的化学修饰领域具有极其重要的意义。该研究通过将两个相互正交的四嗪与叠氮“click把手”设计在一个非天然氨基酸上，得到了可以进行双重生物正交反应的非天然氨基酸。并且结合基因密码子拓展技术（非天然氨基酸编码技术）定点、高效引入到蛋白质的任意位点，将之前复杂，低效率的双氨基酸编码体系转换为简单，高效的单氨基酸编码体系，随后可以在体外通过一锅法实现两种，甚至三种不同效应分子比如荧光、核素、PEG、药物以及核酸的交叉组合定点修饰，进而满足不同的临床需求，如高信噪比肿瘤成像，肿瘤诊疗一体化以及肿瘤杀伤等等 （图1），填补了蛋白质定点高效多修饰领域的空白。

图1：双功能非天然氨基酸充当蛋白质多修饰的click把手

抗体片段偶联荧光与PEG，实现高信噪比肿瘤成像

首先，研究团队针对目前全抗偶联荧光分子进行肿瘤成像周期长，且抗体片段偶联荧光分子半衰期短，成像差的弊端，将PEG与近红外荧光分子定点引入到抗体片段anti-PSMA-Fab中，由于不同PEG大小的调节，可使得该偶联物的半衰期在全抗体与抗体片段Fab之间，在缩短成像周期的前提下，产生了更优的成像效果（图2）。

图2：抗体片段偶联荧光与PEG实现高信噪比肿瘤成像

抗体片段偶联荧光与核素，实现肿瘤一体化治疗

目前蛋白药物分子(如抗体)进行治疗过程中结合显像剂进行实时监测的新型治疗策略在临床治疗领域具有较大需求空间。针对这一问题，他们将近红外荧光与核素分子引入到抗体片段中，构建了小鼠双模态成像模型，实现了对肿瘤检测以及红外辅助手术导航的诊疗一体化的目标（图3）。

图3：抗体片段偶联荧光与核素---实现肿瘤一体化治疗 抗体片段偶联毒素分子与PEG，实现肿瘤高渗透杀伤 他们又构建了 PEG 与药物毒素的 Anti-HER2-scFv 抗体片段偶联物，相比于全抗（150 kDa），该偶联物分子量较小（50 or 70 kDa），但同时比单一scFv（27 kDa）分子量大，在实现更高肿瘤渗透的同时，增强杀伤效果（图4），体现了双修饰抗体片段协同作用的优势。

图4：抗体片段偶联毒素分子与PEG实现肿瘤高渗透杀伤

该工作开发了一套双功能非天然氨基酸位点特异性引入到蛋白质，进而实现蛋白质多功能修饰的平台，可以轻松获得高产量的蛋白质双偶联物和多偶联物。该平台可以使用市售的点击化学修饰试剂，轻松扩展蛋白质的多功能性，从而使其成为将各种功能分子组合引入到蛋白质中的最优选择。通过对抗体片段进行可控的双修饰，其修饰物在前列腺癌和乳腺癌的诊疗中展现了应用潜力。该技术为发展新一代的抗体药物偶联药物（ADC）及发展肿瘤诊疗一体化方案奠定了重要的技术基础。

北京大学药学院刘涛教授课题组博士后王永，硕士研究生韩伯阳以及北京大学第一医院杨兴教授课题组博士研究生张景明为本文的共同第一作者。团队成员谭琳致，蔡文康，李雨轩，苏晔宇，余宇彤，王昕，段小江，王浩宇以及天然药物及仿生药物国家重点实验室仪器平台指导老师师晓萌，王静，医药卫生分析中心仪器平台指导老师钟丽君等也为本研究做出了重要贡献。该研究得到国家自然科学基金《多层次手性物质的精准构筑重大研究》，国家重点研发计划合成生物学专项，北京大学临床+X青年专项，以及北京市杰出青年基金等科研项目的大力支持。