Nature子刊 | 张晓辉/钟涛/李大力合作开发超高活性的腺嘌呤碱基编辑器及超高活性双碱基编辑器

在人类遗传变异类型中，单核苷酸变异(SNV)在疾病相关的突变中占据了近60%1,2，因此开发高效精确的基因编辑工具对于治疗棘手的遗传疾病带来了希望。碱基编辑器（Base editor,BE）最早由哈佛大学David R.Liu开发，是一类可以在不产生双链DNA断裂的基础上高效催化碱基转换，在临床基因治疗领域展现了极大的潜力。目前，碱基编辑器主要包括ABE（Adenine base editor）和CBE(Cytosine base editor)，它们是将Cas9缺口酶（nickase）分别与腺嘌呤脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶融合，实现A-to-G和C-to-T转换1, 2。

CBE, ABE开发之出均存在不同程度的技术缺陷，如如效率低、靶向范围小、产物不纯、“邻近碱基”突变、体积太大、DNA和RNA脱靶等。随着技术发发展，碱基编辑器存在活性低、靶向范围不足、精准性不足、脱靶效应等多个技术缺陷逐渐得到被国内外科学家们攻破。我们前期已开发了克服其技术缺陷的多款新性能碱基编辑器，如克服单一底物限制的双功能碱基编辑器（A&C-BEmax）（Nature Biotechnology, 2020）3、超高活性的胞嘧啶碱基编辑器hyCBEs(Nature Cell Biology, 2020)4, 构建了一系列不依赖天然胞嘧啶脱氨酶家族的“精准且安全”的新型胞嘧啶碱基编辑器—TadA-derived CGBE/CBEs (Td-CGBE/Td-CBEs)（Nature Biotechnology, 2022）5， 编辑窗口为1-2碱基的高精度的腺嘌呤碱基编辑器（ABE9）(Nature Chemical Biology, 2022)6和多个拓展靶向范围的PAM灵活的ABE系统(Protein &Cell, 2018)7等。

然而，目前的ABE在靠近PAM区编辑活性仍然较低，除此之外，可编辑两种碱基底物的双碱基编辑编辑也被报道，因ABE效率低导致A/C同时编辑效率仍然比较低， 这极大的限制了ABE和A&C-BE的广泛的应用。因此，开发超高活性的ABE和双碱基编辑器需求极为迫切。

2023年3月3日，华东师范大学生命科学学院/上海市基因编辑与细胞治疗前沿科学基地张晓辉（现为中国医学科学院苏州系统医学研究所PI）、钟涛和李大力课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“Improving adenine and dual base editors through introduction of TadA-8e and Rad51DBD”的研究论文，该研究通过融合单链DNA结合蛋白Rad51DBD以及TadA-8e，开发了超高活性的腺嘌呤碱基编辑器hyABE，极大的提高了对靠近PAM区A的编辑效率以及超高活性的双碱基编辑器eA&C-BEmax,hyA&C-BEmax，大幅提高对A/C同时的编辑效率。

该研究首先采用了此前开发hyCBE的策略8，在ABEmax,ABE8e上融合单链DNA结合蛋白Rad51DBD,测试了不同的融合策略，发现ABE8e-M-Rad51DBD(hyABE)表现最优，在对hyABE进行25个靶点的评估后，发现hyABE在A2-A9与ABE8e有着相似的编辑效率，但在A10-A15位，hyABE的编辑效率高于ABE8e，最高可提高7倍。

图1：hyABE改造

此前开发的双碱基编辑器(A&C-BEmax)同时实现A/C编辑的效率较低，考虑可能是使用原始版本TadA-TadA*的原因，我们将其替换为活性更高的TadA8e开发出eA&C-BEmax，经21个靶点评估，A-to-G的编辑效率平均提高1.1-10.1倍，C-to-T的编辑效率在靠近PAM区与A&C-BEmax持平，A/C同时编辑的效率平均提升1.8倍，为进一步提高A/C同时编辑效率,在eA&C-BEmax上融合Rad51DBD，开发超高活性双碱基编辑器hyA&C-BEmax,A-to-G的编辑效率平均提升1.2-17.7倍，C-to-T的编辑效率高于eA&C-BEmax，A/C同时编辑效率提升1.9倍。

图2：eA&C-BEmax和hyA&C-BEmax多靶点评估

在脱靶方面，作者通过三个方面（Cas9依赖的DNA脱靶，Cas9非依赖的DNA脱靶和RNA脱靶）评价优化后的hyABE,eA&C-BE 和hyA&C-BE安全性，发现相对于对应的ABE8e 和 A&C-BE， hyABE,eA&C-BE 和hyA&C-BE并不展示更高的脱靶效应，说明优化后碱基编辑具有较高的特异性。

图3：hyABE,eA&C-BE 和hyA&C-BE安全性评价

除此之外，我们将hyABE应用到β-血红蛋白病的基因治疗中，在红细胞前体细胞中(HUDEP-2)验证其治疗潜力，发现hyABE可在HBG1/2 启动区 -113 和-198位更高效地引入激活γ-globin的表达的突变。除此之外，我们也验证了eA&C-BE 和hyA&C-BE在可在HBG1/2 启动区有效联合安装激活γ-globin的表达的突变。说明，优化的hyABE, eA&C-BE 和hyA&C-BE在基因治疗β-血红蛋白病的巨大的治疗潜力。另外，我们在斑马胚胎中也得到了有效验证，hyABE可以在斑马鱼F0胚胎中成功引入纯合rps14E12G致病点突变，使斑马鱼的红细胞表达显著降低，并且没有引起斑马鱼胚胎发育畸形率的升高,展现了在构建点突变动物模型中的优势，A&C-BEs基因编辑工具也在斑马鱼胚胎当中得到了有效的验证。

图4：斑马鱼中引入纯合rps14E12G致病点突变

华东师范大学生命科学院硕士研究生薛念念，博士研究生刘旭，博士后张丹，中国医学科学院苏州系统医学研究所2022级博士研究生吴友明为该论文的共同第一作者，华东师范大学/中国医学科学院苏州系统医学研究所张晓辉研究员，华东师范大学钟涛教授，李大力教授为本文通讯作者，刘明耀教授提供了重要指导与支持。

论文最后通讯作者张晓辉已在中国医学科学院&北京协和医学院苏州系统医学研究所成立独立实验室，主要从事碱基编辑技术的开发、优化及应用研究。近年来，研究成果以第一作者或通讯作者在 Nature Biotechnology、Nature Cell Biology、Nature Communications 等国际学术期刊上发表高水平SCI论文10余篇（其中ESI 1%论文2篇）。研究成果被多家著名学术杂志Nature Review Genetics、Nature Cell Biology和Protein &Cell等做亮点报道。申请包括PCT在内国家发明专利 13项，授权11项。主持国家重点研发课题子课题和国家自然科学基金委等多个项目。课题组所在院所具有高通量测序和高性能生物计算、免疫功能检测、动物实验、RNA分析、生物安全二级实验室等多个技术平台（详见：http://www.ismsz.cn/Web/Default）。研究平台一流、学术氛围浓厚、运行经费充足。实验室目前正在招收副研究员、助理研究员和博士后，欢迎具有酶定向进化、细菌等微生物基因组工程改造、DNA损伤修复机制、蛋白结构理性设计、生物信息、基因编辑等相关研究背景的优秀人才加入。

1. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

2. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).

3. Zhang, X. et al. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nature biotechnology 38, 856-860 (2020).

4. Zhang, X. et al. Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-stranded DNA-binding protein domain. Nature cell biology 22, 740-750 (2020).

5. Chen, L. et al. Re-engineering the adenine deaminase TadA-8e for efficient and specific CRISPR-based cytosine base editing. Nature biotechnology (2022).

6. Chen, L. et al. Engineering a precise adenine base editor with minimal bystander editing. Nature chemical biology 19, 101-110 (2023).

7. Yang, L. et al. Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants. Protein & cell 9, 814-819 (2018).