eLife | 陈子江/刘洪彬团队揭示SSH2参与精子顶体形成的新机制

目前，世界范围内育龄期夫妇不孕不育的比例约为8-12%，其中男性因素所致约占50%， 而精子生成异常是导致男性不育症的主要遗传因素之一【1】。精子生成是未成熟精子细胞经历顶体形成等一系列细胞形态重塑事件，最终分化为具备运动能力和受精潜能成熟精子的过程【2】。位于精子头部前段的顶体是精子特化的囊泡样细胞器，其内含有的多种蛋白水解酶可协助精子穿越卵子透明带，在精卵融合过程中发挥重要作用【3】。顶体的正确组装依赖于细胞骨架系统介导的前顶体囊泡协同运输及囊泡融合，研究此过程涉及的分子事件及调控机制对临床男性不育症病因的解析具有重要的意义。 微丝骨架（Filamentous actin, F-actin）在有丝分裂、迁移以及分化等细胞生命活动中发挥着重要作用。正常的微丝空间结构是维持微丝骨架生理功能的基础，其形成主要依赖于微丝结合蛋白（actin-binding proteins）参与介导的微丝骨架动态重塑【4】。丝切蛋白（COFILIN）是一类负责特异性解聚丝状肌动蛋白的微丝结合蛋白，其活性主要受其自身Ser-3位点磷酸化修饰状态影响，丝切蛋白磷酸酶家族（Slingshot phosphatase family, SSHs）作为目前已知少有的丝切蛋白特异性磷酸酶，此前被报道在肿瘤侵袭迁移中发挥了重要作用，但SSHs在雄性配子发生过程中的生物学功能仍不清楚。 2023年3月21日，山东大学生殖医学研究中心陈子江/刘洪彬团队在eLife上发表了题为 The Slingshot phosphatase 2 is required for acrosome biogenesis during spermatogenesis in mice 的研究论文。该研究基于Ssh2基因敲除小鼠模型以及SSH2标签小鼠模型，揭示了SSH2在精子生成过程中参与调控顶体形成的生物学功能。此前，已有组织学研究结果显示SSH2蛋白在小鼠睾丸中呈高表达【5】。为了探究SSH2在雄性配子发生过程中的作用，研究团队采用基因编辑技术分别构建了Ssh2基因敲除小鼠以及携带血凝素（hemagglutinin, HA）蛋白标签的SSH2-HA标签小鼠，发现雄性敲除小鼠表现为不育，睾丸内未见除圆形精子外的精子细胞，雌性敲除小鼠生育力未见明显异常。通过进一步组织学分析，研究人员确定Ssh2敲除后精子生成过程被阻滞在Ⅱ-Ⅲ期，精子细胞发育终止于早期step 1–3圆形精子阶段，曲细精管腔可见数量增多的凋亡样细胞。为了寻找Ssh2敲除鼠生精阻滞的具体原因，研究人员首先利用TUNEL染色结果证实Ssh2敲除鼠曲细精管和附睾内凋亡生殖细胞数量显著增加，同时伴有睾丸内凋亡信号分子如BAX、Caspase-3等的异常表达，提示Ssh2敲除会导致精子细胞凋亡。 通过睾丸压片技术观察花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）标记的精子细胞，研究人员进一步确认敲除鼠的顶体形成过程受阻于Golgi期，并观察到Ssh2−/−精子细胞中散在分布的顶体碎片。利用透射电镜技术，研究人员发现Ssh2−/−圆形精子内前顶体囊泡不能融合形成一个完整的顶体泡，伴有高尔基体堆增厚。随后研究人员检测高尔基体标志蛋白GM130（在维持高尔基体结构稳定性及囊泡运输中发挥重要作用）发现Ssh2−/−精子细胞胞质内GM130荧光信号异常聚集，这些结果表明SSH2在精子细胞顶体形成过程中发挥了重要作用（图1）。随后，研究人员观察了不同发育阶段小鼠SSH2表达谱，发现其在睾丸内的表达自PD21起显著升高，提示其可能参与了圆形精子发育过程。SSH2主要定位于精母细胞及圆形精子胞质，在圆形精子内SSH2显著富集于PNA标记的顶体区域。此外，研究人员还利用SSH2-HA标签小鼠证实了SSH2在顶体形成过程中的动态性表达。以上结果表明SSH2与顶体形成的功能相关性。

图1 Ssh2敲除后精子顶体形成阻滞的形态学分析：(A)敲除鼠精子细胞顶体形成阻滞于Golgi期；(B)透射电镜示敲除鼠精子前顶体囊泡不融合现象；

研究人员随后对SSH2参与精子细胞顶体形成的机制进行探究，发现生殖细胞内F-actin结构受Ssh2敲除影响而改变，Ssh2−/−生殖细胞内聚集有大量团块状FITC-phalloidin信号，睾丸压片结果表明Ssh2敲除后F-actin倾向自发聚合，且其胞内定位与顶体结构的分布无关，暗示Ssh2敲除扰乱了精子细胞内F-actin的结构重塑过程。此外，研究人员发现Ssh2敲除改变了精子细胞中囊泡运输/融合相关蛋白GOPC以及LC3在顶体区域的定位模式，提示SSH2在前顶体囊泡运输/融合过程中发挥了关键作用。Ssh2−/−睾丸蛋白中检测到显著升高的磷酸化状态COFILIN及过表达的F-ACTIN，睾丸切片中P-COFILIN荧光强度明显增强，并发现Ssh2−/−精子细胞中同时出现的聚集样F-actin结构及胞内广泛分布的P-COFILIN。由此，证实SSH2通过维持COFILIN磷酸化平衡参与微丝结构重塑，进而在顶体形成过程中发挥了重要调控性作用。 近年来，微丝系统被发现作为骨架平台参与高尔基体与新生顶体间的物质运输，但对这一生物学过程涉及的分子机制仍知之甚少。此项研究鉴定了Slingshot家族成员SSH2是顶体形成事件的一个关键调控因子，并阐明了SSH2通过直接调控COFILIN磷酸化水平，参与微丝结构重塑，进而影响精子细胞内前顶体囊泡运输/融合过程的分子机制，进一步展示出微丝结构的可塑性及其动态调控在顶体形成过程中发挥的独特作用，也为解析不育症的致病机制提供了新思路 (图2）。图2 SSH2参与顶体形成的模式图

山东大学陈子江院士、刘洪彬教授和香港中文大学-山东大学生殖遗传联合实验室路钢教授为共同通讯作者，山东大学许珂博士生、苏献伟博士和中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心方凯伦博士后为该文章的共同第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.7554/eLife.83129